Friday, April 20, 2012

Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis

Judul Percobaan
Kromatografi Lapis Tipis
Tujuan Percobaan
Pemisahan asam-asam amino dalam suatu campuran dengan cara kromatografi lapis tipis.
Landasan Teori
Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan tahun 1938 oleh Ismailoff dan Schraiber. Adsorben dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai peunjang fase diam. Fase bergerak akan merayap sepanjang fase diam dan terbentuklah kromatogram. Ini dikenal juga sebagai kromatografi kolom terbuka. Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan tinggi dan mudah untuk memperoleh kembali senyawa-senyawa yang terpisahkan (Khopkar, 2007: 155).
Pada dasarnya kromatografi lapis tipis (KLT atau TLC = Thin layer Chromatography) sangat mirip dengan kromatografi kertas, terutama pada cara melakukannya. Perbedaan nyata terlihat pada media pemisahannya, yakni digunakan lapisan tipis adsorben halus yang tersangga pada papan kaca, aluminium atau plastic sebagai pengganti kertas. Lapisan tipis dsorben ini pada pross pemisahan berlaku sebagai fasa diam (Soebagio, 2002: 87).
Bila KLT dibandingkan dengan KKt, kelebihan khas KLT ialah keserbagunaan, kecepatan, dan kepekaannya. Keserbagunaan KLT disebabkanoleh kenyataan bahwa di samping selulosa, sejumlah penjerap yang berbeda-beda dapat disaputkan pada plat kaca atau penyangga lain dan digunakan untuk kromatografi (Harborne, 1987; 13).
Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai (Clark, 2007).
Bahan adsorben sebagai fasa diam digunakan silica gel, alumina, dan serbuk selulosa. Partikel silica gel mengandung gugus hidroksil di permukaannya yang akan membentuk ikatan hidrogen dengan molekul-molekul polar. Alumina lebih disukai untuk memisahkan senyawa-senyawa polar lemah, sedangkan silica gel lebih disukai untuk memisahkan molekul-molekul seperti asam-asam amino dan gula. Magnesium silikat, kalsium silikat, dan arang aktif mungkin juga dapat digunakan sebagai adsorben (Soebagio, 2002; 87-88).
Zat yang paling umum digunakan sebagai adsorben adalah alumina, silica gel, dan bubuk silica. Zat-zat tersebut dibuat bubuk tepung yang selanjutnya tersebar di atas lempeng dan dibuat sedemikian rupa hingga ketebalannya merata. Kadang-kadang suatu pengikat, misalnya plaster parte ditambahkan untuk menambah daya lekat zat tersebut. Setelah kering, selanjutnay diaktivasi dengan pemanasan dalam oven pada temperature 110 oC selama beberapa jam. Cara kerjanya sama dengan kromatografi kertas. Deteksi terhadap noda timbul kadang-kadang lebih mudah dibandingkan kromatografi kertas karena dapat dipakai cara-cara yang lebih umum (Tim Dosen Kimia Analitik, 2010: 13).
Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan jel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH. Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Gambar ini menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika.(Clark, 2007).
Eluen pengembang dapat berupa pelarut tunggal dan campuran pelarut dengan susunan tertentu. Pelarut-pelarut pengembang harus mempunyai kemurnian yang tinggi. Terdapatnya sejumlah kecil air atau zat pengotor lainnya dapat menghasilkan kromatogram yang tidak diharapkan (Soebagio,2002; 88).
Lebih banyak macam pelarut yang telah digunakan pada KLT dibandingkan dengan KKt dan pada umumnya terdapat ruang gerak yang lebih leluasa dalam perbandingan pelarut yang digunakan dalam pengembang. Bilangan Rf jauh lebih kurang terulangkan dibandingkan pada KKt dank arena itu harus menggunakan satu senyawa pembanding atau lebih untuk penandaan (Harborne, 1987: 14).
Deteksi noda KLT terkadang lebih mudah dibandingkan dengan kromatografi kertas karena dapat digunakan teknik-teknik umum yang lebih banyak. Kerap kai, noda tidak berwarna atau tidak berpendar jika dikenai sinar ultra violet dapat ditampakkan dengan cara mendedahkan papan pengembang pada uap iod. Uap iod akan berinteraksi dengan komponen-komponen sampel baik secara kimia atau berdasarkan kelarutan membentuk warna-warna tertentu (Soebagio, 2002 : 89).
Dalam beberapa kasus, dimungkinkan untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak dengan jalan mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino. Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat atau ungu (Clark, 2007).
Satu kekurangan KLT yang asli ialah kerja penyaputannya, pelat kaca dengan penjerap. Kerja ini kemudian agak diringankan dengan adanya penyaput otomatis. Meskipun begitu, dengan menggunakan alat itu pun tetap diperlukan tindakan pencegahan tertentu (Harborne, 1987; 13).
Alat dan Bahan
Alat
Chamber
Pipa Kapiler
Pensil
Penggaris
Silet
Klem Kayu
Oven
Bahan
Plat KLT
Asam amino standar (alanin, as. Glutamate, as. Aspartat, tirosin)
Larutan pengelusi A (Butanol : as. Asetat : air = 80 : 20 :20)
Larutan Pengelusi B (Propanol : air = 70 : 30 v/v)
Sampel yang akan diuji
Larutan nihidrin
Cara Kerja
Menyiapkan asam-asam amino standard dan asam amino yang akan diidentifikasi
Menotolkan ± 1 tetes dari masing-masing asam amino pada 2 buah plat KLT yang berbeda dengan jarak ± 1 cm dari ujung bawah plat.
Membiarkan beberapa saat hingga plat mongering
Meletakkan asing-msing plat dalam chamber yang berisi pengelusi A atau B. mengusahakan sedemikian rupa agar spot tidak tercelup pada pengelusi.
Membiarkan plat dalam chamber hingga larutan pengelusi sampai pada garis atas (± 6 cm dari penotolan)
Mengambil Plat dalam chamber dan mengeringkannya.
Menyemprotkan larutan ninhidrin pada plat dan mengeringkannya
Memasukkan plat pada oven hingga timbul warna/noda
Mengukur jarak noda dan mengitung nilai Rf-nya

Hasil Pengamatan
Komponen Pengelusi A Pengelusi B
warna Jarak noda Jarak eluen Rf Warna Jarak noda Jarak eluen Rf
Standar A Ungu tua 0,20 6 0,03 Coklat 2,1 6 0,35
B Ungu muda 1,10 6 0,18 Ungu muda 2,2 6 0,37
C Merah 0,20 6 0,03 Merah 1,9 6 0,32
D Merah muda 0,15 6 0,02 Ungu muda 0,9 6 0,15
Campuran x Merah muda 0,15 6 0,02 Ungu muda 1,3 6 0,22
Keterangan :
A = alanin
B = Tirosin
C = As. Glutamat
D = As. Aspartat
Analisis Data
Pengelusi A (Butanol : as. Asetat : air = 80 : 20 :20)
Alanin (ungu tua)
Jarak yang ditempuh noda = 0,20 cm
Jarak eluen = 6 cm
Rf= (jarak yang ditempuh noda)/(jarak eluen)= (0,20 cm)/(6 cm)=0,03
Tirosin (ungu muda)
Jarak yang ditempuh noda = 1,10 cm
Jarak eluen = 6 cm
Rf= (jarak yang ditempuh noda)/(jarak eluen)= (1,10 cm)/(6 cm)=0,18
As. Glutamat (Merah)
Jarak yang ditempuh noda = 0,20 cm
Jarak eluen = 6 cm
Rf= (jarak yang ditempuh noda)/(jarak eluen)= (0,20 cm)/(6 cm)=0,03
As. Aspartat (merah muda)
Jarak yang ditempuh noda = 0,15 cm
Jarak eluen = 6 cm
Rf= (jarak yang ditempuh noda)/(jarak eluen)= (0,15 cm)/(6 cm)=0,02
Sampel x (merah muda)
Jarak yang ditempuh noda = 0,15 cm
Jarak eluen = 6 cm
Rf= (jarak yang ditempuh noda)/(jarak eluen)= (0,15 cm)/(6 cm)=0,02
Pengelusi B (Propanol : air = 70 : 30 v/v)
Alanin (coklat)
Jarak yang ditempuh noda = 2,1 cm
Jarak eluen = 6 cm
Rf= (jarak yang ditempuh noda)/(jarak eluen)= (2,1 cm)/(6 cm)=0,35
Tirosin (Ungu muda)
Jarak yang ditempuh noda = 2,2 cm
Jarak eluen = 6 cm
Rf= (jarak yang ditempuh noda)/(jarak eluen)= (2,2 cm)/(6 cm)=0,37
As. Glutamat (Merah)
Jarak yang ditempuh noda = 1,9 cm
Jarak eluen = 6 cm
Rf= (jarak yang ditempuh noda)/(jarak eluen)= (1,9 cm)/(6 cm)=0,32
As. Aspartat (ungu muda)
Jarak yang ditempuh noda = 0,9 cm
Jarak eluen = 6 cm
Rf= (jarak yang ditempuh noda)/(jarak eluen)= (0,9 cm)/(6 cm)=0,32
Sampel X (ungu muda)
Jarak yang ditempuh noda = 1,3 cm
Jarak eluen = 6 cm
Rf= (jarak yang ditempuh noda)/(jarak eluen)= (1,3 cm)/(6 cm)=0,22
Pembahasan
Pada percobaan ini dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan asam-asam amino dalam suatu campuran dengan cara KLT. Asam-asam amino standar yang digunakan pada percobaan ini yaitu alanin, tirosin, as. glutamate dan as. Aspartat . selai itu, ada pula larutan sampel x yang akan diidentifikasi.
Pada percobaan ini digunakan 2 pengelusi yaitu pengelusi A yang terdiri dari butanol : as. Asetat : air dengan perbandingan 80 : 20 : 20 dan pengelusi B yang terdiri dari propanol : air dengan perbandingan 70 30 v/v.
Asam-asam amino standard an sampel x ditotolkan pada plat KLT kemudian dikeringkan dengan tujuan menguapkan HCl yang terdapat pada larutan. Setelah kering, plat dimasukkan ke dalam chamber dimana spot tidak boleh menyentuh pelarut/pengelusi. Hal ini karena jika spot terkena/menyentuh pengelusi, spot tidak akan bergerak ke atas melainkan merembes ke dalam pengelusi. Pada saat eluen telah mencapai batas atas, plat dikeluarkan dan dikeringkan. Setelah itu, plat disemprot dengan ninhidrin. Ninhidrin merupakan oksidator lemah yang jika bereaksi dengan asam-asam amino akan menghasilkan hidrindantin dan senyawa aldehid dengan melepaskan gas CO2 dan NH3. Setelah penyemprotan, plat dikeringkan kemudian dipanaskan dalam oven. Tujuan pemanasan adalah untuk mempercepat reaksi antara ninhidrin dan asam amino sehingga membentuk noda pada plat.
Setelah terbentuk noda, harga Rf dihitung dengan rumus :
Rf= (jarak yang ditempuh noda)/(jarak eluen)
Sehingga dari analisis data diperoleh niai Rf :
Pengelusi A
Alanin (ungu tua), Rf = 0,03
Tirosin (ungu muda), Rf = 0,18
As. Glutamat (merah), Rf = 0,03
As. Aspartat (merah muda), Rf = 0,02
Sampel X (merah muda), Rf = 0,02
Pengelusi B
Alanin (coklat), Rf = 0,35
Tirosin (ungu muda), Rf = 0,37
As. Glutamat (merah), Rf = 0,32
As. Aspartat (ungu muda), Rf = 0,15
Sampel X (ungu muda), Rf = 0,22
Menurut teori, keempat asam amino tersebut akan menghasilkan warna ungu saat bereaksi dengan ninhidrin sedangkan nilai Rf-nya yaitu alanin (0,22), tirosin (0,14), as. Glutamate (0,24), dan as. Aspartat (0,17). Perbedaan antara teori dan hasil pengamatan disebabkan oleh cara penotolan yang kurang baik.
Untuk mengetahui sampel x, dapat dilihat dari warna maupun harga Rf-nya kemudian membandingkannya dengan warna Rf dari asam-asam amino standar yang digunakan. Dari keempat asam amino yang ada, sampel x memiliki kesamaan warna dan nilai Rf dengan asam aspartat dibandingkan dengan ketiga asam amino yang lainnya. Dimana sampel x pada pengelusi A berwarna merah muda dengan Rf = 0,02 sama dengan asam aspartat (merah muda) dengan Rf = 0,02. Sedang pada pengelusi B memiliki warna yang sama yaitu ungu muda dengan nilai Rf untuk sampel x = 0,22 san as. Aspartat = 0,15 yang hasil ini lebih mendekati disbanding asam amino lain. Sehingga dapat disimpulkan bahwa sampel x merupakan as. Aspartat.
Adapun reaksi antara ninhidrin dengan asam amino, yaitu :
Alanin
O O
CH3 – CH – COOH + OH  OH
NH2 OH H
O O
+ CH3 – CHO + NH3 + CO2 
Tirosin
O
HO– CH2 – CH – COOH + OH 
NH2 H
O
O
OH + HO– CH2 –CHO + NH3 + CO2
H
O
As. Glutamat
O
HOOC– CH2 – CH2 – CH – COOH + OH 
NH2 H
O
O
OH + HOOC – CH2 - CH2–CHO + NH3 + CO2
H
O
As. Aspartat
O
HOOC– CH2– CH – COOH + OH 
NH2 H
O
O
OH + HOOC – CH2 - CH2–CHO + NH3 + CO2
H
O
Kesimpulan dan Saran
Kesimpulan
Rf untuk asam-asam amino pada pengelusi A yaitu Alanin = 0,03, Tirosin = 0,18, As. Glutamat = 0,03, As. Aspartat = 0,02, Sampel X = 0,02
Rf untuk asam-asam amino pada pengelusi B yaitu Alanin = 0,35, Tirosin = 0,37, As. Glutamat = 0,32, As. Aspartat = 0,15, Sampel X = 0,22
Sampel x adalah as. aspartat
Saran
Pada saat penotolan jangan terlalu melebar karena dapat mempengaruhi laju migrasi sehingga dapat pula berdampak pada harga Rf-nya
Saat pencelupan/perendaman, usahakan noda tidak mengenai/menyentuh pengelusi

DAFTAR PUSTAKA

Clark. 2007. Kromatografi Lapis Tipis. Http://www.chem-is-try.org/author/Jim-clark/Kromatografi-lapis-tips.html. diakses pada 18 April 2010.
Harborne. 1987. Metode Fitokimia. Bandung : Penerbit ITB.
Khopkar. 2007. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta : UI-Press.
Soebagio. 2002. Kimia Analitik II. Malang : JICA.
Tim Dosen Kimia Analitik. 2010. Penuntun Praktikum Kimia Analitik II. Makassar : Laboratorium Kimia, FMIPA, UNM.

JAWABAN PERTANYAAN
Yang terjadi jika protein terhidrolisis oleh asam kuat yaitu akan menghasilkan asam-asam amino penyusunnya.
Prinsip dasar KLT adalah untuk identifikasi kualitatif untuk analisis kuantitatif dimana fasa diam adalah lapisa tipis adsorben yang halus di atas suatu lempeng gelas atau aluminium (Soebagio, 2002: 87).
Asam amino yang diidentifikasi adalah asam aspartat

No comments:

Post a Comment